Na przełomie XVI/XVII w. przebywał w Zamościu jako kaznodzieja Cyryl Staurowiecki. Ten rad widziany w domu Zamoyskich bazylianin, obok wielu dzieł religijnych pozostawił też powstały w Zamościu rękopis. Bywał też Józefat Brażyc (zm. 1683) oficjał arcybiskupi, krzewiciel kultu św. Józefata i cudotwóca. Co najmniej od 1639 zwykle 2-3 zakonników pracowało przy cerkwi przedmiejskiej. W 1700 Anna Zamoyska w miejsce usuniętych z cerkwi miejskiej prawosławnych sprowadziła bazylianów z Chełma. Na podstawie przywileju ordynackiego z 26 IX 1718 otrzymywali 400 zł rocznej jałmużny, w połowie na kapłana i bractwo. Nadal jednak było tu nie więcej niż 3 zakonników. Przez z górą pół wieku utrzymywany był tylko, nie klasztor, lecz skromna rezydencja, do 1771 filia monasteru w Werchratej. Po synodzie monaster zamojski znalazł się w nowoutworzonej prowincji koronnej bazylianów.
W 1753 za superiora Maurycego Rubca położono kamień węgielny, pod klasztor. Następnego roku Jan Jakub Zamoyski ofiarował 2 folwarki i w 1757-62 z jego fundacji powstał piętrowy, murowany klasztor kryty gontem, o 9-osiowej fasadzie, z celami po obu stronach długiego korytarza (na parterze były 3, na piętrze 9 cel i mieszkanie o 3 pokojach przełożonego). W 1776-79 rozbudowany. Cerkiew i budynek klasztor stały w jednej linii, stykając się narożami (połączone przejściem na piętrze). Zespół uzupełniały: stajnia, wozownia, studnia i drewiany karmnik (?).
Bazylianie (Wasylijany) utrzymywali się z darów i własnego gospodarstwa (m.in. 7 koni, 19 krów). W 1754 ordynat ofiarował bazylianom folwark Szopinek (folwarczek Wendryjowski) i 30 tys. funduszu na utrzymanie 6 braci. Wzrosła samodzielność klasztoru (przedstawiciel przy kapitule prowincjonalnej w Białymstoku). Klasztor jako jedyny w diecezji nosił miano stauropigialnego. Oprócz ihumena (przełożony), było tu zwykle przynajmniej 7 zakonników (wśród nich 2 misjonarzy), w 1772 ponad 20. (m.in. kaznodzieje, spowiednicy). W 1788 żaden z zakonników nie znał języka rosyjskiego.
Od 1762 w ciągu 27 lat odbyli 58 misji, należąc do najaktywniejszych ośrodków misjonarskich. Działali przeważnie w dobrach ordynackich, ale wyruszali też na zaproszenie Potockich, Sapiehów czy Radziwiłłów na Podole, Polesie, Ukrainę, docierając m.in. do Targowicy i Humania (gdzie mieli spowiadać 10 tys. osób). Miarą uznania dla talentów kaznodziejskich było zapraszanie ich nawet przez Żydów. W czasie misji zginął męczeńsko w Humaniu przełożony o. Herakliusz Kostecki - jeden z najbardziej zasłużonych bazylianów zamojskich, autor cennej kroniki klasztornej.
Bazylianie prowadzili nowicjat. Ok. 1764 powstało przy cerkwi bractwo św. Onufrego. Czasowo mieściła się też przeniesiona ze Lwowa szkoła teologiczna (1759-63), a po spaleniu monasteru ławrowskiego w Poczajowie, od 1767 Studium Filozoficzne. Była biblioteka. Wielu zakonników drukowało w Zamościu rozprawy naukowe. Spod pióra Augusta Sławińskiego wyszło obszerne kompendium matematyczne (1782). Pracował tu przez pewien czas Julian Dobryłowski - osobne hasło) uważany za twórcę narodowej literatury ukraińskiej.
Od 1762 należy do nich folwark Łabuńki (18 ha), później też na Majdanie (20 ha). W aktach z l. 70. XVIII w. i późniejszych przewijają się nazwy  folwarków Franki, Tramkowy i Hazówka (Hazowskie), Karpińskie. Od 1792 bazylianie posiadali cerkiew i wieś Łabuńki, a w 1796 3 folwarki miejskie (na ul. Gęsiej i na Przedmieściu Lubelskim - 2).
Pod koniec XVIII w. klasztor podupadł (długi, rozluźnienie dyscypliny). Nie pełnią już misji. Zajmują się przede wszystkim pracą duszpasterską na terenie Zamościa. Ponadto prowadzą szkołę podstawową  oraz wykładają filozofię w Liceum. W 1802 było 17 zakonników razem z klerykami na filozofię do Akademii chodzącymi, w 1804 tylko 7 (w tym 3 kleryków), w 1806 - 11. Klasztor wbrew przepisom zakonnym udostępniano później na kwatery dla oficerów (w 1823 rodzina lekarza wojskowego). Administrator dekanatu skarżył - ogólny nieporządek, zaniedbanie i nieprzyzwoitość są tu widocznymi, co pochodzi z niestosownego wyboru lokatorów w celach zakonnych mieszczących się.  W zamojskim klasztorze przebywał w 1842-44, po czym za lekturę zakazanych książek więziony do 1849 w zamojskiej twierdzy,  zasłużony potem dla cerkwi unickiej na Podlasiu ks. Sofroniusz Trocewicz.
Po odcięciu od tradycyjnych terenów misyjnych zakon ulegał marginalizacji, przestał być też unicką elitą intelektualną. Celowo rozpowszechniano o nich złe opinie, po oddaniu miasta przestał łożyć na bazylianów ordynat, a świątynia zaczęła popadać w ruinę. Doszło do zatargu z komendantem twierdzy, gdyż przełożony klasztoru odmawiał posługi religijnej rosyjskim wojskowym (interweniował biskup). Do bazylianów przyłączono ogrody franciszkańskie.
W 1804 dochód z folwarku o pow. 70 morgów pola oraz 15 mrg. łąki przynosił 817 zł reńskich. W 1 poł. XIX w. posiadali folwark na Majdanie, rezydował tam zakonnik odprawiający nabożeństwa w tamtejszej kaplicy (stała naprzeciw szkoły).
Po powstaniu listopadowym komendant twierdzy podjął starania o usunięcie bazylianów i zamianę cerkwi na prawosławną. Wskutek polityki antyunijnej do bazylianów uczęszczało coraz mniej wiernych. W 1860 był już tylko superior, kaznodzieja i kapłan - emeryt. Ukazem z 24 X 1864 władze zlikwidowały klasztor w Zamościu, a także w Lublinie, Chełmie i Białej (parę lat później także warszawski). Cerkiew (osobne hasło: Cerkiew p.w. św. Mikołaja) przejęli prawosławni, a budynek klasztorny wobec złego stanu w l. 70. XIX w.  rozebrano.

 * W klasztorze miał na ich zaproszenie gościć w 1699 car Piotr Wielki, biorąc udział w dyspucie religijnej z papieskim nuncjuszem.
 * Klasztor przynależał do prowincji w Białymstoku, następnie w granicach zaboru galicyjskiej i od 1810 chełmskiej  z monasterami w Białej, Chełmie, Lublinie i Warszawie w 1850 rzem 19 zakonników. W 1823 w tym czasie było tylko 2 zakonników a pracowało na nich w klasztorze i folwarku 8 osób - parobek, 2 gospodynie, służące, pastuch i trzej "chłopcy". Na folwark majdański składały się 3 stodoły, 5 chlewów, spichlerz, szopa, stodoła, obora, żuraw, płot z chrustu na kołki dębowe.
 * Klasztor w 1828 - 6 kominów, na parterze 15 okien, 5 cel, refektarz, kuchnia, 2 izby, spiżarnia; na piętrze 17 okien, 7 cel, mieszkanie przełożonego (3 pomieszczenia).
 * W l. 40-tych XIX w. w klasztorze znajdował się cenny zabytkowy krzyż. Jego rysunek wykonał gubernator gen. Albertow, po czym miał być wysłany do Lublina dla zupełnego rozpoznania obrazów na tymże krzyżu wyrobionych, których nie podobna odrysować na papierze.
 * W opuszczonym klasztorze nie mógł zamieszkać prawosławny ksiądz, ponieważ zajmowali go mieszkańcy świeccy, np szewc Guławski, który nawet dla "błazeństwa" zawiesił szyld z butem obok herbu ...biskupiego. (za dr B. Sawą).