Pierwszych z nich werbowali na zlecenie Jana Zamoyskiego - Szymon Szymonowic i Krzysztof Dłuski. Jesienią 1593 zawarli w Krakowie umowę z Wawrzyńcem Starnigielem (osobne hasło), Janem Ursinusem (osobne hasło) i Melchiorem Stefanidesem (osobne hasło). W III 1594 do Zamościa przybyli Turski i Birkowski. W 1596 przybył Adam Burski (osobne hasło). Wszyscy byli doktorami filozofii. Jako następny zjawił się Maciej Jaworowski (1597) - doktor praw, wraz z przybyciem otrzymując również stopień doktora filozofii. W 1603 przybył pierwszy doktor teologii - Włoch Dominik Convalis (osobne hasło). Zamoyski starał się o sprowadzenie dwu wybitnych humanistów Flamandczyka Justusa Lipsiusa i Francuza Marca Mureta, nie zgodził się na to papież Grzegorz XIII. Do śmierci Kanclerza przyjęto 15 profesorów, lecz na katedrach pozostawało wówczas 11 lub 12. Były lata, gdy przybywało po 8 (1782), 6 (1774), 5 (1645) nowych profesorów.
Przez Akademię przewinęło się co najmniej 225 profesorów, wśród nich 172 doktorów filozofii oraz 47 doktorów obojga praw, 41 teologii i 19 medycyny. Wielu posiadało po 2 doktoraty, a trzech szczyciło się potrójnym doktoratem. Ponad 40 z nich stopnie doktorskie otrzymało za granicą, głównie w Padwie (26) i Rzymie. Przeważnie  jednak posiadali dyplomy zamojskie i krakowskie (dr filozofii 81:79). Zdecydowana większość profesorów trafiała do Zamościa poprzez Uniwersytet Krakowski, nie tylko jako doktorzy, ale również bakałarze. Do poł. XVIII w. szczególnie wielu z nich było lwowianinami. Wśród profesorów znajdujemy też 12 rodowitych zamościan oraz kilkunastu absolwentów Akademii Zamojskiej (pierwszym był Szymon Piechowicz). Obok Polaków w Zamościu wykładało również 7 obcokrajowców (5 Włochów, Szkot i Francuz), ale wszyscy razem wykładali łącznie nie więcej niż 10 lat. Aż 4 Włochów zmarło w Zamościu (jeden z nich ledwie kilkanaście dni po objęciu katedry).
W Zamościu akademicy dzielili się na profesorów wyższych - wykładających na właściwych katedrach akademickich i niższych, zajmujących się nauczaniem początkowym. Profesorowie zwykli klas wyższych według aktu fundacyjnego otrzymywali 230 zł rocznie i nosili zwyczajowy tytuł carissimus (najdroższy). Uposażenia profesorów mniejszych wynosiło 150 zł, a ich nazwiska poprzedzało excellens (znakomity). Wyższe płace dostawali profesorowie później fundowanych katedr. Na dochody profesorów składały się także opłaty za studia i egzaminy na stopnie naukowe. Nie polowano jednak na zamożniejszych synów szlacheckich wnoszących wyższe opłaty, lecz z obawy zatrucia nowinkami zadowalano się plebejuszowskimi trójgroszakami. Czyniono tak w obawie przed utratą przyszłych dochodów z kanonii i probostw, jakimi obdarzano zasłużonych profesorów duchownych. Profesor mógł otrzymać probostwo po 6 latach, kanonię po 12 a prałaturę po 18.
O karierę akademicką było stosunkowo łatwo. Początkowo przybywali tu na profesorskie katedry ze stopniami doktorskimi. Później zwykle byli to (często wybrani drogą konkursu) bakałarze, którzy obejmowali niższe klasy i potem stopniowo awansowali na zwalniane coraz bardziej znaczące katedry (warunkiem objęcia wyższej katedry było uzyskanie doktoratu). Wobec niskich uposażeń ambitniejsi świeccy nauczyciele szybko stąd odchodzili. Była to jedna z głównych przyczyn upadku Akademii. Profesorowie zaniedbywali obowiązki, wyręczali się zastępcami (często byli nimi starsi studenci), zajmowali się intratną działalnością panegiryczną. Ilustracją upadku było chociażby polecenie wydane profesorom, aby na wykłady przybywali odziani, a nie w negliżu, jak się to dotąd praktykowało (od 2 poł. XVII w. tak, jak i rektorzy nosili togi, a dodatkowo także biret i pierścień). Profesorom, którzy nie mieli słuchaczy polecono odsiadywanie lekcji we właściwych, pustych audytoriach. Gdy doszło wreszcie do gruntownej reformy uczelni, w 1746 na 18 katedr - obsadzonych było 12, a z tych na 6 niezbyt zresztą regularnie wykładano.
Spora część profesorów tylko przejściowo, czasem na niecały rok tylko zatrzymywała się w Zamościu. Wśród nich byli jednak i tacy, którzy po około 40 i więcej lat zasiadali na miejscowych katedrach (Kacper Solski, Walenty Ptarmius, Sz. Piechowicz, Jan Krzycki, Marcin Fołtynowicz, Adrian Krobski, Paweł Krzeczkiewicz, Franciszek Grabowicz, Michał Pruski, Stanisław Duńczewski, Klemens Podziomkiewicz), a infułatami zostali czterej (Starnigiel, Skwarski, Kłopocki, Unikowski). Od 1669 przywilejem królewskim wszyscy profesorowie mogli używać tytułów szlacheckich (bez herbów), nie uznawanych jednak przez szlachtę. Wśród profesorów byli dwaj późniejsi biskupi.

 * W 1646 Żydzi zamojscy zobowiązali się  dostarczać profesorom corocznie 20 librów pieprzu i 16 uncji szafranu w dwu ratach na Boże narodzenie i Wielkanoc.