Na księgozbiór akademicki złożyły się przede wszystkim książki Jana Zamoyskiego, gromadzone z myślą o Akademii i przekazane jej testamentem. Oprócz książek napłynęły do biblioteki rękopisy, nabywane nie szczędząc środków przez jego wysłanników (m.in. Ciekliński, J. Herburt, P. A. Taranowski) we Włoszech, Grecji, Turcji. Już w 1596 były w niej rzadkie i cenne manuskrypty również starożytnych pisarzy, w języku łacińskim, greckim, hebrajskim, ormiańskim, lecz znajdowały się jeszcze w skrzyniach, a była ich liczba niemała i w pięknej oprawie. Wkrótce jednak powstający księgozbiór znalazł miejsce w wybudowanym obok Akademii niewielkim domu, a opiekę nad nim powierzono jednemu z kanoników. Po śmierci kanclerza rozrost biblioteki zmniejszył się. W 1632 przybyło 1428 po Szymonie Szymonowicu. Zbiory wzrastały przez liczne dary profesorów Akademii (Księgozbiory prywatne), zapisujących bibliotece od kilkunastu do kilkuset tomów. Wojciech Bodzęcki oprócz księgozbioru zapisał bibliotece na jej utrzymanie połowę kamienicy, książki darował też profesor Kasper Trądkowski i Stanisław Riccius. W 1655 przejęto księgozbiór zm. Jana Leoniceniego. W 1674 testamentem Gryzeldy Wiśniowieckiej w Akademii znalazły się księgi z zamojskiego zamku. Książki ofiarowali również dobrodzieje spoza Zamościa Piotr Oleśnicki oraz protonotariusz apostolski Maciej Gągalski. W 1757 biskup przemyski ofiarował 232 druki i 100 rękopisów po prof. i kanoniku J. Amlerskim.
W 1648 biblioteka znalazła się w nowym gmachu (na piętrze w płn.-zach. narożniku - duża sala z antresolą). Dopiero w 1675 powstał katalog książek (9 działów, każdy dzielony na  bardziej szczegółowe tematy), z ok. 4 tys. tytułami. Był też obszerny zbiór wykładów profesorskich (rękopisy).
Z biblioteki korzystać mogli również studenci. Niepokalana czystość i świeżość kart już po jej zamknięciu nie świadczyła o zbytnim zainteresowaniu lekturą. Na ogół zaniedbany, podkradany księgozbiór w krótkim czasie doczekał się nowego katalogu, sporządzonego przez Tomasza Ormińskiego (1699), lecz niesumienni profesorowie, nie oddając książek, znowu wprowadzili nieład. W 1776 wystarano się z Rzymu o zgodę na trzymanie ksiąg zakazanych i heretyckich. W ostatnim okresie istnienia Akademii doszło do wyznaczenia spośród profesorów stałego bibliotekarza, zwiększenia funduszów i znacznego powiększenia księgozbioru.
Mimo dość konserwatywnego charakteru naukowego większości dzieł, bogactwo i rozmaitość zbioru odpowiednio wykorzystane mogło postawić uczelnię w gronie nienajcelniejszych może, ale poprawnych wszechnic europejskich. Wg J. Lelewela nie mało młodsza od innych biblioteka nie tylko liczbą ale i dobrocią dzieł dorównywała wielu krajowym księgozbiorom. Nie było w niej wielu inkunabułów, natomiast liczne, cenne rękopisy (kilkaset starych pism greckich i łacińskich). Biblioteka posiadała m.in. wspaniale iluminowany pergaminowy rękopis dziejów narodu żydowskiego Józefa Flawiusza (1466), kilka wartościowych rękopisów medycznych z XV w., bliżej nie znane dzieło Asklepiosa (rękopis z X w., na papierze chińskim), słownik autorów kościelnych i świeckich (1461), historia Polski (z 1435 oraz późniejszy rękopis) i żywoty arcybiskupów gnieźnieńskich (iluminowane na pergaminie i skromniejsze pisane ręką autora) Jana Długosza, a także bezcenny "kodeks zamojski" (XV w.) zawierający najstarszy odpis Kroniki Galla Anonima, ofiarowany Akademii przez Jana Sobiepana. Było też wiele rękopisów pisanych przez profesorów i studentów. Wśród książek na uwagę zasługiwały dzieła dotyczące sztuki, pochodzące z biblioteki Jana Zamoyskiego.
Po kasacie Akademii księgozbiór stał się własnością Ordynacji, ale z braku miejsca pozostał w Akademii. Dokonany spis zawierał przeszło 1,5 tys. rękopisów i prawie 4600 książek, ujętych w 8 działach (152 półki w 11 szafach). Co czwarta dotyczyła teologii. Było też m.in. po ok. 500 dzieł prawniczych, medycznych i historycznych. Poza łacińskimi (80%), były książki polskie (301), francuskie (239), włoskie (229) oraz łącznie 36 książek o hiszpańskich, niemieckich i angielskich tytułach. W bibliotece przechowywano także archiwum i gotówkę. Centralne miejsce zajmował długi dębowy stół z 24 szufladami.
Jest wzmianka o zabraniu z biblioteki w 1809 dwu fur książek. W 1811 Stanisław Zamoyski wywiózł księgozbiór do Warszawy i tam ustanowił Bibliotekę Ordynacji Zamojskiej - do 1939 czołową warszawską placówkę naukową.

 * Kazał wystawić bibliotekę bardzo dobrze rozporządzoną, znaczną xiąg zwłaszcza w językach greckim i ormiańskim. I znajdują się przy tem rzadkie i ciekawe manuskrypta. Te xięgi nie były ułożone, widziałem je w skrzyniach, jest ich liczba nie mała i w pięknej oprawie. (Bonifacy Vanozzi)
 * Akademia miała piękną bibliotekę, w której znajdował się najpiękniejszy jaki widziałem rękopis Długosza: Żywoty arcybiskupów Gnieźnieńskich na pergaminie, ozdobiony malowaniami, przedstawiającymi tych pasterzy i ich herby. Rękopis ten, jak i wiele innych rzakości bubliograficznych przeszły na własność Ordynatów. (L. Dembowski Moje wspomnienia, 1898)
 * Opracowany przez prof. Adriana Krobskiego w 1675 księgozbiór zawierał dzieła z zakresu teologii (ponad 500), prawa (ok. 300), medycyny (ok. 500), filozofii (ok. 300), historii (ponad 700), retoryki (ponad 200), matematyki, astronomii, geometrii, archeologii, astrologii i geografii (ok. 250), poezji i gramatyki (ok. 450) oraz tzw "libri exotici" czyli trudne do zakwalifikowania, m.in. słowniki, utwory sceniczne, ekonomiczne.
 * Po kasacie Akademii inwentarz sporządzony na życzenie Stanisława Kostki Zamoyskiego zawierał w 8 działach następujące liczby dzieł: teologia 1157, humaniora 848, filozofia 689, historia 495, medycyna 490, prawo 474, poetyka 360, zastrzeżone 360. Wg języków - łaciński 3748 (82%), polski 302, francuski 239, włoski 229, hiszpański 20, niemiecki 11, angielski 5. Spis sporządził monsieur Benoist consierge (stróż!) de l'Academie. Z jego zapisków wypożyczeń wynika, że wielu cennych dzieł XVI-wiecznych nie zwrócił - będący postrachem bibliotek w ówczesnej Polsce - Tadeusz Czacki.
 * Słynny polski kolekcjoner i postrach bibliotek Tadeusz Czacki korzystał z księgozbioru Akademii (już po jej zamknięciu) i nie zwrócił Klonowica Victoria Deorum, Reja Zwierciadła, Nowego Testamentu tłumaczonego z greckiego i innych ksiąg.