Ob. kościół. Na podstawie przywileju Jana Zamoyskiego z 1589 pozostający w schizmie Grecy wystawili własnym kosztem w 1602-4 drewnianą cerkiewkę w murach miasta. W 1606 opiekę nad nią przejęło ruskie bractwo cerkiewne (Prawosławie). W 1618-31 wzniesiono w jej miejscu murowaną już cerkiew ufundowaną przez Tomasza Zamoyskiego (proj. Jan Jaroszewicz, dekoracje Jan Wolff). Wkrótce Rusini zdominowali niewielką grupkę Greków, która to społeczność w niedługim czasie znikła zupełnie.
5 IV 1699 cerkiew przystąpiła do unii, a w 1700 osiedli przy niej bazylianie. W 1690-99 nad kruchtą z chórem muzycznym wzniesiono 5-kondygnacyjną wieżę (proj. Jan Michał Link). W 3 ćw XVIII w. pokryto cerkiew gontem, dobudowano nową kruchtę z 2 ołtarzami (św. Bazylego i NMP) i przybudówkami z obu stron prezbiterium (dla diakonów i naczyń liturgicznych, ob. w płn. zakrystia). Do wieży przylegał wystawiony w 2 poł. XVIII w. klasztor, z którego można było przejść do biblioteki na piętrze wieży (nad babińcem) i lamusa (skarbczyka). Pod nawą znajdowały się 3 krypty - miejsce pochówków księży i zakonników - jedna z wejściem w posadzce (obecnie niedostępne, w zasypisku odnajdywano w 2008 fragmenty trumien i szczątków ludzkich). Wg opisu z 1892 cerkiew i dzwonnica białe, dachy czerwone, cebulaste kopuły zielone a niewielkie kule pozłacane.
W 1720 w cerkwi odbyła się inauguracja 
synodu zamojskiego. Powstało też przy niej nowe bractwo św. Onufrego. Ok. 1764 staraniem superiora Modesta Trusiewicza powstały ołtarze boczne św. Onufrego i św. Walentego.
W l. 30. XIX w. komendant twierdzy podjął starania o zamianę cerkwi na prawosławną. Sama świątynia w 1840 zaczęła grozić zawaleniem (zniszczenia dopełniały padające latem i jesienią deszcze, które tak mury zrujnowały, że co chwila rozstępujące się cegły wypadają zagrażając dla ludu śmiercią i zawaleniem). Dopiero jednak po kasacie zakonu i gruntownym remoncie (na ten czas dla wiernych urządzono cerkiew w jednym z pomieszczeń Akademii) 25 VII 1871 cerkiew objęli prawosławni (nabożeństwa przez kilka lat odbywały się w gmachu Akademii), którzy użytkowali ją do 1915. Cerkiew "nikolska" otrzymała m.in. charakterystyczne cebulaste hełmy tzw. latarń nad nawą i prezbiterium  oraz nowy duży dzwon. Rozebrano klasztor, a w nowym miejscu wystawiono popówkę (ob. dom zakonny - rozbudowany i nadbudowany).
Malownicza, oryginalna bryła cerkwi zaskakuje różnorodnością i prawie nic nie straciła ze swej oryginalnej urody i należy do cenniejszych zabytków Zamościa. Poza charakterystycznym dla cerkwi południowych (mołdawskich) planem, nosi typowe cechy XVII-wiecznej architektury zamojskiej. Ośmioboczna, przysadzista, o bogatej artykulacji najniższa ze staromiejskich wież (38 m) wyróżnia się bogatym, późnobarokowym hełmem i otworami strzelniczymi, gdyż ze względu na położenie położona pełniła w razie konieczności funkcje obronne. Pod masywną, czworoboczną kopułą z dekoracyjną latarnią znajduje się bardzo mała, niska, kwadratowa, nie mieszcząca nawet stu osób nawa, poszerzona o 2 późniejsze półkoliste absydki. Prezbiterium jest krótkie, zamknięte trójbocznie. Między nawą i niską kruchtą jest tzw. pronaos z chórem muzycznym, nad którym zbudowano wieżę. Wszystkie człony wnętrza wydzielone są arkadami. W 1858 kopuła i wieża pokryta białą blachą, z pozłacanym krzyżem,  było razem 11 okien w nawie 6, podłoga kamienna (w 1808 nowa, tylko w zakrystii ceglana, pod chórem drewniana. Ołtarz wielki malowany był na niebiesko.
Czaszę sklepienia i konchy absyd zdobią bogate późnorenesansowe, polichromowane sztukaterie o koncentrycznym układzie listew i dekoracyjnych plakietach (m.in. anioły ze skrzydłami o pawich piórach, plakietki z syrenami, motywy arabeskowe). Zachował się też skromny, późnorenesansowy portal (podobny w Rynku Wielkim 16) prowadzący do pierwotnej kruchty i kropielnica z czarnego marmuru (XVII w.).
Nie zachowało się natomiast bogate niegdyś wyposażenie, m.in. krzyż z 1 poł. XV w. i przysłane w 1648 przez patriarchę Konstantynopola tzw. carskie wrota snycerskiej roboty, z 6-piętrowym ikonostasem w dobrym guście greckim, z miniaturami ojców kościoła wschodniego i ewangelistów. W ołtarzu gł. był  obraz Matki Boskiej włoskiego pędzla (być może to ten, który zasłynął później w Werchratej cudami) a na zasuwie Ukrzyżowanie. W prezbiterium jeszcze po lewej był ołtarz z ikoną św. Mikołaja z sukienką, mitrą i łańcuchem (spalony, w 1859 namalowany nowy przez Gałęzowskiego), po prawej ołtarz Opieki MB - ikona MB z Dzieciątkiem z sukienką srebrną i koronami. W nawie głównej po lewej św. Onufrego szkoły flamandzkiej a naprzeciw po prawej św. Walentego (na zasłonie św. Bazyli). W kruchcie był jeszcze rzeźbiony ołtarzyk św. Bazylego oraz rzeźbiarska drewniana ambona, organy (z 1762, następne z 1844). Były również  Kielich z piękną rzeźbą, cedrowy krzyż w bizantyjskiej oprawie.
Pod koniec l. 60 XIX w.  za sprawą ks. Reszetyłowicza zburzono przepyszne ołtarze boczne, a także z zewnątrz herby Polski i Zamojskich, fundacji któregoś z nich.
 W 1917 cerkiew wyświęcił i został pierwszym rektorem o. Dominik. Spis dokonany 27 VIII 1918 wymieniał carskie wrota z 52 obrazami, 8 obrazów w ramach stojących, 10 wiszących, krzyże, 4 chorągwie, szereg sprzętów, jak 9 stolików liturgicznych, 4 lichtarze, trochę książek. Sama świątynia była wówczas wewnątrz malowana na olejno, z zewnątrz na biało. Ogrzewana była 4 piecami kaflowymi i posiadała 7 malowideł (wizerunki świętych) w sztukateriach na sklepieniu nawy. Dzwonnica była uszkodzona przez podrąbanie filarów skutkiem ściągania dzwonów. Pod kierunkiem arch. Kranza usunięto hełm i zlikwidowano kopułki.
W 1918 cerkiew przejął kościół katolicki, rekoncyliowany 20 XI 1918. W 1941-44 świątynię jeszcze raz użytkują prawosławni (Niemcy oddali ją Ukraińcom), a 21 I 1945 została rekoncyliowana.

 * W 1589 wyszedł przywilej zezwalający m.in. budowę cerkwi w obrębie murów. Budowę przerwano po pewnym czasie. Dopiero wzięli się do niej Obywatele i Bractwo Ś. Mikołaja, które na nie odebrało Dyplom, od Gedeona Biskupa Lwowskiego w r. 1608, a który zatwierdził Tomasz Ordynat w r. 1621 i razem surowo nakazał kończyć rozpoczętą fabrykę około cerkwi. (J. Jędrzejewicz Historya Kollegiaty)
* Niegdyś cerkwią schyzmatycką. W 1648 patryarcha carogrodzki przysłał malarzy dla odmalowania obrazów w drzwiach cerkwi, obrazy te dobrym guście greckim, wieków późniejszych, drzwi całe bogato złocone. przy końcu XVII w. uniatom zwrócona
(Niemcewicz). Patryarcha carogrodzki w 1648 własnym kosztem odnowić kazał obrazy, Są one w stylu greckim wieków  późniejszych. ("Tygodnik Ilustrowany" 1878)
 * Rudomicz w 1660 opisał, jak niejaki diakon Filipowicz zakopał tej cerkwi zakopał 400 czerwonych złotych, które odnaleźli się trzej bawiący w ziemi chłopcy, a Filipowicz ofiarował  79 na dokończenie malowideł cerkiewnych.
 * Wieżę wieńczył 1,5 m krzyż z kutego żelaza oraz kula miedziana i mająca 2,5 m obwodu, pierwotnie złocona, potem malowana na czarno, wreszcie srebrno, a podczas konserwacji w 1998 na nowo pozłocona, także krzyż. W środku przestrzelonej kilkakrotnie kuli znajdowała się 30 cm rura z dokumentami (jeden zaczynający się od Aleksander, prawdopodobnie z l. 20. XIX w.).
 * Wg opisu z 1828 ołtarz główny był snycerskiej roboty, pomalowany na niebiesko z obrazem Matki Boskiej (na zasuwie Chrystus Ukrzyżowany, w prezbiterium po lewej obraz św. Mikołaja, po prawej Matki Boskiej Opieki, w ołtarzu w nawie po lewej św. Onufry (ramy sklanne promienie około głowy, laur którym opasany, berło, korona srebrem pozłacane), po prawej św. Walenty oraz małe ołtarze poświęcone św. Mikołajowi i Matce Boskiej. Ponadto m.in. 3 krzyże procesyjne, tylko 2 ławki, drewniany konfesjonał, marmurowa kropielnica i ambona, 3 monstrancje i 7 kielichów, 21 ornatów.
 * Z raportu ks. A. Zienkiewicza z 28 IV 1841 - Cerkiew zamojska stojąca od kilkuset lat. tylko czasami była reperowana, a bardziej klejona i stała do 1840 roku przynajmniej nie tak grożą upadkiem. 24 VII 1840 r. sklepienia i mury rozsypały się, a ustawiczne później deszcze przez całe lato i jesień dopełniły rujnacji, że co chwila rozsypują się, cegły wypadają i zagrażają śmiercią dla ludu.
 * Na czas remontu w 1867 urządzono zastępczą cerkiew w jednej z sal d. Akademii. Biały złocony ikonostas z sosnowego drzewa wykonał miejscowy stolarz Fryderyk Nejman. Składał się z 5 dużych ikon: Ostatnia wieczerza, Zbawca, Matka Boża, Archanioł Gawriła, Archidiakon Stefan oraz 4 małych ikon na carskich wrotach z wizerunkami Ewangelistów. Przeniesiono tu
czasowo z cerkwi ołtarz boczny.
* Po 1871 przeniesiono do cerkwi starą ikonę Wniebowstąpienia Pańskiego, w czystym bizantyjskim stylu, (90x53 cm), która mogła  pochodzić nawet z XV w. i łączona jest z cerkwią o tym wezwaniu na tych terenach z przed powstaniem Zamościa, później stojącej na przedmieściu i w ostatnim czasie znajdować się w cerkwi w pałacu Zamoyskich. Ale też z tej okazji specjalnie przywieziona z Rosji. Jej losy po zamknięciu cerkwi nie znane.