Pierwszym rektorem mianowany został 15 III 1595 Melchior Stefanides. Następny pochodził już z wyborów, które corocznie odbywały się w maju, a na urząd ten mógł być wybrany tylko przez 2 lata z rzędu. Rektor dobierał sobie do zarządu radnych. Rektor kierował Akademią (w 1610 decydujący głos w sprawach uczelni przyznano jednak scholastykowi kolegiackiemu). Zajmował pierwsze miejsce podczas wszelkich uroczystości i posiedzeń akademickich, zwoływał je, utrzymywał archiwum, sądził profesorów (w I-szej instancji) i studentów (bez apelacji), układał plany zajęć, dozorował bieg studiów, przyjmował młodzież do Akademii.
Nosili togi, które nie miały jednak stałego koloru. Publicznie rektor ukazywał się z berłem akademickim.
Wybory rektorskie odbyły się 189 razy (nie znane są nazwiska 4 rektorów), a funkcje te pełniło 51 profesorów (tylko trzecia część z nich była osobami świeckimi). Rekordzistą był Adrian Krobski, w 1676-1709 wybierany na rektora 15 razy. 11-krotnie rektorem był Marcin Fołtynowicz, 10 razy Klemens Podziomkiewicz, po 8 - Kacper Solski, Stanisław Niewieski i Dominik Rydulski - ostatni rektor akademicki. Do najbardziej zasłużonych dla Akademii należeli: Adam Burski, K. Solski, Andrzej Kłopocki, M. Fołtynowicz, Bazyli Rudomicz i D. Rydulski.

 * Wg Potockiego w spisie rektorów opuszczony został Jan Kowalski dr filozofii, zapewne dlatego, że w 1648 w czasie oblężenia, gdy wszyscy prawie profesorowie z miasta się powynosili, on na czele młodzieży i kilku pozostałych, którzy go rektorem obrali wraz z załogą dzielnie się przyczynił do odparcia szturmu kozackiego.