Jedyny w Zamościu obraz europejskiej klasy, należy do arcydzieł malarstwa religijnego w zbiorach polskich. Niejasne jest pochodzenie tego wybitnego, znacznych rozmiarów dzieła (2,5x2,5 m). Uważano, że przywiózł je najprawdopodobniej z Włoch w 1652 Jan Sobiepan Zamoyski i ofiarował Kolegiacie. Miał też być darem Marcina Zamoyskiego (w 1866 miał datę "1683"!), albo też nawet zostać ofiarowanym Hetmanowi przez Uniwersytet Padewski. Początkowo zawieszony został prowizorycznie w innej kaplicy i dopiero po wybudowaniu w 2 ćw. XVIII w. nowego, rokokowego ołtarza znalazł się w obecnym miejscu. Przykurzony niczyich oczu nie zwracający obraz ocenił i znawcom ukazał  Stanisław Kostka Zamoyski.
Swoim wytwornym kolorytem, subtelnym rysunkiem, całym tym jakby przyciszonym, trochę chłodnym pięknem zafascynował Kajetana Koźmiana (k. XVIII w.), nie tylko zachwycił, ale i długo zastanawiał Juliana U. Niemcewicza (1816). Snuto domysły, co do autorstwa, przypisując Zwiastowanie nawet jednemu z największych malarzy średniowiecza Fra Angelico, innemu wybitnemu artyście Andrei Del Sarto, czy jeszcze innemu florentyńczykowi zm. w 1607 Alessandrowi Alloriemu (wg notatki w archiwum Zamoyskich), autor aż 14 kopii Zwiastowania, naśladowca Michała Anioła.
Przybywających do Zamościa w ciągu XIX w. oczarowywał prześliczny koloryt, mimo niszczącej wilgoci. Na obraz czynili zakusy: znany kolekcjoner Edward Rastawiecki (starał się o restaurację, ale obawiano się zamiany na kopię) i Maurycy Zamoyski (administrator Kolegiaty nie pozwolił na zabranie obrazu w lepsze warunki i zastąpić kopią). W 1869 uszkodzona była niebezpiecznie twarz i ręka Maryi, a co gorsze późniejszym nieudolnym poprawianiem bardzo zniekształcona.
Wg opinii Rafała Hadziewicza (3 ćw. XIX w.) i potwierdzających ją późniejszych hipotez, jego autorem jest jeden z wybitniejszych malarzy florenckich XVII w. Carlo Dolci (1616-1685). Obraz powstał w 1650 (data MDCL widoczna w oparciu ławy). Pod wielkim wpływem Fra Angelico - Dolci stworzył nowy typ Madonny wyzbytej z przypadkowych, realistycznych rysów, odznaczającej się łagodnością, wdziękiem i słodyczą. Wszystkie te cechy nosi obraz zamojski, będący swobodną, barokową kopią słynnego XIV-wiecznego wizerunku z kościoła Santissima Annunziata we Florencji. Kapitalna plastyka, doskonały rysunek, bogactwo kolorystyczne, zwłaszcza w mieniących się odcieniami tęczy szatach anioła, szczegółach przedmiotów (korona, płaszcz), a przede wszystkim delikatna, alabastrowa, jakby oświetlona od wewnątrz twarz Maryi stawia dzieło w rzędzie największych dokonań Dolciego, znanych z galerii i katedr Londynu, Monachium, Genui, Florencji, Mediolanu, Wiednia, Kolonii, Budapesztu.
Zamojskiemu Zwiastowaniu ustępują wykonane wg tego samego pierwowzoru kopie z kościoła kapucynów w Krakowie i katedry poznańskiej (przed wojną znanych było 9 kopii tego obrazu, najstarszy w zbiorach M. Czetwertyńskiej w Warszawie). Stało się ono również tematem kopii wykonanych do kościoła w Tarnogórze i pałacu w Kozłówce. Bardzo podobne Zwiastowania znajdują się w katedrze kolońskiej i klasztorze w Foligno.
W 1906 powstała sprawa wypożyczenia do kopiowania i zamiany obrazu na kopię, za co ordynat chciał dużej ofiary. 4 XII 1924 obraz znalazł się w Księdze Zabytków Ruchomych Inwentarza Państwowego. Jeszcze przed wojną na co dzień przesłaniała obraz szafirowa kotara ze złotymi frędzlami, odsłaniany tylko w odpust. W 1931 (prof. Jan Rutkowski na Zamku Królewskim, wrócił do Kolegiaty w III 1931) i 2008 poddany konserwacji. Też: Leonardo da Vinci w Zamościu.

 * Najpiękniejszy jest obraz Zwiastowania Najświętszej Panny. Rozłożenie onego jest proste, spokojne i ujmujące. Matka Boska wyrażona jest siedząca w gotyckim krześle, z koroną na głowie, pełna skromności i słodyczy; dno obrazu, gotyckie także wystawia ozdoby. Zstępujący Duch święty, w postaci gołębia, rzuca światło na świętą dziewicę; anioł klęczy przed najświętszą Panną. Kolory najpiękniejsze, przewyborne draperye, wszystko nie tylko zachwyca oko, lecz je mile długo zastanawia. Nie masz nazwiska malarza; najpodobniejszą atoli rzeczą, iż obraz ten jest pędzla Carla Dolce (J. U. Niemcewicz, 1816).
 * Mieliśmy sposobność przypatrzeniu się sławnemu obrazowi Zwiastowania N.P.Marii, pięknemu dziełu szkoły dawnej z czasów jeszcze przed Rafaelem. Szczególnie anioł z taką sztuką oddany, taki wyraz niewinności, świętości i pokory jaśnieje na twarzy i całej postawie jego, że wzbudza cześć w patrzących i piętnem jest niepospolitego talentu malarza. Użycie złota do malatury i uchybienia w perspektywie zdradzają czasy jego przed-rafaelowskie i wzbudzają podziwienie, że koloryt mimo dawności czasu, na sukniach N.P.Marii i anioła, cudnie udrapowanych, zachował się w całej czystości i żywości dotychczas, chociaż znaki wilgoci wskazują, że obraz nie najstaranniej był zachowany. Obraz  ten przypomniał mi galerię w Wiedniu i Dreźnie, w której niepospolite miejsce mógłby zajmować. (ze wspomnień Ignacego Maciejowskiego żołnierza gen. Dwernickiego, 1831)
 * W kolegiacie znajduje się obraz przedstawiający Nawiedzenie Najśw. Panny Maryi wykonany mistrzowską ręką, jeden z najpiękniejszych tworów znajdujących się Polsce. Obraz ten ofiarowany był Janowi Zamoyskiemu przez Akademię w Padwie. Dzięki wypada oddać nadspodziewane zrządzonemu trafowi, że ten drogi upominek nie popadł dotąd zagładzie, która w części pochłonęła najdrożse wspomnienia. ("Kolumb Pamiętnik opisom podróży..." 1829)
 * W kaplicy lewej nawy świątyni znajduje się ciekawy obraz z XVI w., przedstawiający Zwiastowanie. Obraz ten formą swą rysunkowo-plastyczną i kolorytem nawiązuje do Angelica, lecz pod względem dekoracyjnym sprawia do pewnego stopnia wrażenie czegoś antykizowanego; przypisywany jest Carlo Dolce lub Pietro Dandini. ("Bluszcz" 1934, nr 22)
 * Korona świętej dziewicy tak doskonale oddana, że robi wrażenie, jakby była ze złota, wysadzana drogimi kamieniami i przybita do obrazu. Razi tylko aureola, jak wielki talerz z żółtej blachy. Obydwie postacie bardzo oddalone od siebie, niemal ram dotykają, zaś wnętrze prawie puste i tylko w górze unosi się gołąbek. Środek najwięcej zniszczony. Potrzebna od zaraz ręka mistrza, by ocalić to dzieło od powolnej śmierci. (prof. Adrian Krzyżanowski, 1850)
 * W ołtarzu jest pyszny obraz Zwiastowania N.M.P Niektórzy sądzą, że to dzeło Rafaela. Nie dzielę tego zdania, bo korona N. Panny tak pracowicie wykończona, iż z dala zdaje się jakoby do obrazu była przybita. Złudzenie jest tak wielkie, że ja sam drabinę kazałem przystawić, aby się przekonać, że jest malowaną. Podobnych szczegółów Rafael nie wykończał i zdaje mi się, że to dzieło szkoły weneckiej a najprędzej Bellina. Koloryt wówczas arcyżywy, ale teraz po upływie pięćdziesięciu [?] znacznie ucierpiał. (Paweł Popiel, wyd. 1933)
 * Największą osobliwością świątyni jest niepospolitej piękności obraz w  jednym z bocznych ołtarzów lewej ściany kościoła umieszczony i wyobrażający Niepokalane Poczęcie P. Maryi. Wyborne to malowidło włoskiej szkoły przez Jana Zamojskiego z Włoch przywiezione, zachowało prześliczny dotąd koloryt pomimo, że od wilgoci wiele ucierpiało; postać N. Panny i twarz anioła zwiastującego są rzadkiej piękności. (Przewodnik dla podróżujących po Europie..., 1851)
 * Przedewszystkiem zwraca uwagę obraz Zwiastowania NMP szkoły florenckiej Carlo Dolce. Jakiej wiary, ile natchnień świętych wymagał tak wzniosły przedmiot, aby mógł być pochwycony na płótno! Postać anioła, wyraźnie maluje niebiańskiego wysłańca do córy ludzkiej, zajętej modlitwą i zwiastujący jej zostanie Bogarodzicą. Wyraz twarzy w tych osobach prawdziwie boski! Natchnienia święte zstępują na widza! Wyznać można śmiało, iż jakkolwiek uczeń Jakuba Vigneli zajmuje drugorzędne stanowisko między artystami europejskimi, to obraz Zwiastowania znajdujący się w Kolegiacie, należy do najszczytniejszych jego utworów. ("Kronika Wydarzeń Krajowych" 1859 nr 42)
 * Zwraca uwagę znakomite Zwiastowanie w stylu bizantyjskim, dzieło włoskiego mistrza podobno Andrea del Sarto, jak twierdzi malarz i prof. szkół w Lublinie Urbański. Twarz i ręka NMP uszkodzone i poprawianiem popsute. ("Kurier Lubelski" z 1869)
 * Obraz Zwiastowania NPM, jak mówią pędzla Carlo Dolce. Przy braku wszelkiej pretensji do znawstwa ośmieliłbym się być innego zdania i wyrazić śmiałe przypuszczenie, że obraz ten jest wytworem dwóch epok, i że jest dziełem dwóch malarzy. Najśw. Panna zwykle przedstawiana jest pochylona lub klęcząca, tutaj siedzi – a postać Jej  nosi cechy szkoły sieneńskiej lub umbryjskiej, zaś Anioł klęczący zupełnie innego pędzla i układu, wydaje się być dziełem hiszpańskiego Murilla lub jego szkoły – nie przypomina mi obraz ten w niczem charakteru utworów Carlo Dolce. (L. Dembowski Moje wspomnienia, 1878)
  * Kiedy z przyjaciółmi zwiedzałam kolegiatę w Zamościu, co chwilę się upewniali: Wow czy nie wow? Powinno mi się podobać? A jeśli się okaże, że to nieudolna kopia albo amatorski bohomaz? Podnoszę kciuk: "Zwiastowanie" Carlo Dolciego. Malarz barokowy, ale mamy do czynienia ze swobodną olejną kopią wcześniejszego o 300 lat fresku.  Moi towarzysze oddychają z ulgą. Dopiero teraz przyglądają się uważniej. "A więc miałem przeczucie? Ładne twarze, zgrabne dłonie i zdaje się, że dobra perspektywa? Owszem , geometria bez zarzutu: zaraz po odkryciu perspektywy malarze lubili się ja eksponować. (...) Perspektywą można się też popisać się we wnętrzu: skośnie ułożona posadzka  albo elementy architektury wyznaczają punkt zbiegu jej linii. Ten chwyt wykorzystał anonimowy florentyńczyk, którego naśladował Dolci. Ale przecież zamojskie płótno jest urokliwe nie dlatego, że namalował je znany artysta, a o jego wartości nie przesądza poprawnie wykreślona perspektywa. XIII-wieczna ikona, na której płaskie postaci są jakby przyklejone na złotym tle, niekoniecznie jest od niego słabsza. (Anna Arno Sztuka nie gryzie, GW z 29-30 VIII 2015)
 * Wizytacja Kolegiaty z 1671 wielki obraz Zwiastowania odnotowywała przy zakrystii, mógł się pojawić w kaplicy w 1695 - w wydatkach stolarz robiący gzyms i przybijający obraz, chłopi dźwigający drabiny by przytwierdzić obraz (ten?), jednak w 1714 też brak wzmianki o wielkim obrazie ołtarzowym w kaplicy.
 * W 1860 wzgl. 1866 za zgodą inf. Baranowskiego kopię obrazu zdjął b. nauczyciel rysunków w gimnazjum lubelskim  Lubański.
Dokumenty. W odnalezionej w papierach Stanisława Kostki Zamoyskiego włoskiej notatce („TZ” z 1938) – Obraz, który jest u pana hr. Zamoyskiego pochodzi od malarza Allori i dalej ręką tegoż ordynata – Notatka na temat Zwiastowania, które znajduje się Kolegiacie w Zamościu. W rejestrze wydatków podróżnych  Sobiepana z 1646 („ZKK” z 1990) – Obraz Zwiastowania  40 talarów.
 * Kalendarz Ilustrowany z 1877 - Ktokolwiek zwiedzał Zamość, nie mógł zaprzeczyć wrażeniu, jakie czyni ten obraz. Nikt jednak jeszcze dobadać się nie mógł jego pochodzenia, ani określić czyjej był ręki (...). Na podstawie stylu, piękna istotnego duchowego i plastycznego, na podstawie otoczenia dopełniającego całość malowniczą obrazu, pomimo zupełnego braku dokumentów, możemy określić dawność dzieła i szkołę z jakiej wyszło, samo dzieło biorąc za dokument wprawdzie jedyny, ale najważniejszy i zupełnie wystarczający.
Piękność wyrazu twarzy i postaci, rysunek poprawny, gibkie linie fałd ubrania, świadczą najdowodniej, że obraz ten należy do szkoły włoskiej. Są w nim zadatki wszystkiego, tego, czem florencka i rzymska sztuka na początku XVI wieku zajaśniały; są jednak inne jeszcze właściwości obrazu, które nam każą twierdzić, że jest o sto lat dawniejszy od założenia kościoła w Zamościu (1580), i że pochodzi z epoki, w której panowało pewne zbliżenie między szkołą włoską a holenderską, czyli najprawdopodobniej może by być ręki Antonella da Messina, stanowiącego łącznik pomiędzy Van Dyckiem, a całą szkołą włoską, tak lombardzką, jak florencką i wenecką.
Twierdzenie to uzasadniamy w następujący sposób: Architektura stanowiąca tło  obrazu, przedstawia połączenie romańskich gęstych a drobnych łuków z nagłówkami z czasów odrodzenia, jako też kobierce i posadzka włoskie mozaikowe. Układ postaci spokojny i nieco sztywny, zwłaszcza N. Panny, aureola około głów a zwłaszcza korona na głowie Dziewicy, aż do wyrazów wychodzących z jej ust „Ecce ancilla Domini” są zabytkami wieku czternastego i początków piętnastego, zarówno szkoły włoskiej, jak hollenderskiej i czeskiej, współczesnej Antonellowi da Massina (1445-1478). Postrzeżenia te nie sprzeciwiają się  ani podaniu, ani chociażby pewności, że obraz został przez założyciela Zamościa i kościoła Jana Zamoyskiego ofiarowany, jest bowiem od niego znacznie dawniejszy. Autorstwo też Antoniego da Messina nie zmniejsza jego wartości, pod względem sztuki bowiem Antoni Mamertini pozostanie zawsze w historyi jednym z jej filarów i rozsiewców dobrego ziarna.
 * Wg K. Mastalińskiego („TZ” 1998) – przez analogię do kolegiackiego obrazu św. Mikołaja – data 1650 na obrazie, mogła oznaczać nie czas powstania, lecz umieszczenia w kaplicy, a dr B. Sawa nie wykluczała proweniencji z kręgów malarzy z kręgów niderlandzkich.